黄素依赖的氧化还原酶广泛存在于自然界，其主要参与生物体内能量和物质转化。该类酶在天然产物的骨架合成及后修饰等过程中起着重要的作用，部分酶还被开发成生物催化剂应用于工业生产。但是该类酶在催化氧化还原等反应的过程中对底物大多具有较强的区域和立体选择性。

Rubrolones是一类芳香托酚酮天然产物。在前期的研究中，中科院昆明植物所黄胜雄研究团队报道了其生物合成基因簇、关键中间体1及吡啶环形成的分子机制（Nat Commun 2016, 7, 13083）。随后德国的Hedge Bode团队报道了其类似物isarubrolones的生物合成并发现其部分基因簇的在链霉菌中异源表达不仅能合成苷元1还伴随还原去芳构化的化合物2的生产 (Angew Chem Int Ed 2017, 56, 4945)，但是化合物2的形成机制未被解析。

近日，黄胜雄研究团队在两个基因簇中发现一类新的具有多功能和非立体选择性的黄素依赖酶-RubE7/IstO，其能还原化合物1托酚酮环上三个不同位置双键形成2，同时还具有氧化化合物6中单键形成碳碳双键的功能。

首先，在缺失糖合成基因的rub BGC的异源表达菌株中分离得到4个新的托酚酮环被还原的化合物2-5，并通过核磁和晶体确认化合物的结构。其中晶体数据和手性柱分析发现4为外消旋体。随后作者对这些化合物尤其是外消旋体的来源产生兴趣。通过基因的敲除、互补和前体喂养实验确认基因簇中的单个黄素依赖的RubE7酶在体内能催化1形成化合物6并再进一步还原形成2-5。说明RubE7能还原三个不同位置的双键。

为进一步确认RubE7的功能，作者进行体外酶学实验，发现以1为底物时只能催化生成6，不生成2。而以6为底物时，也不生成2，而是快速的通过消耗氧气发生逆反应生成1和过氧化氢。这说明RubE7催化的碳碳双键还原反应是可逆的，同时也解释了有氧气的条件下RubE7为什么不能进一步还原6合成2。在严格无氧的条件下，RubE7能催化6形成2。同时作者还获得了RubE7的同功能蛋白IstO的晶体结构，发现该酶与硝基还原酶(nitroruductase)具有相似的整体结构：催化口袋位于两个亚基之间（蛋白的表面）。通过分子对接和催化口袋大小的计算，发现IstO蛋白的催化口袋比文献报道的硝基还原酶大一倍，使得底物可以在催化口袋中发生旋转和翻转，这可能是为什么单个酶能还原三个不同位置双键的原因。作者推测由于空间位阻的原因发生翻转的概率比旋转的低，从而还原产物里只有量少的化合物4为外消旋体，其他化合物为光学纯。接着通过氨基酸定点突变实验发现关键的His106残基可作为碱起到拔质子的作用，从而促使逆反应（氧化形成碳碳双键）的发生。

总之，作者发现一类新的多功能的且不具有立体选择性的氧化还原酶-RubE7/IstO及其催化机制。该发现不仅解析了新的酶学机制，拓展了我们对黄素家族催化功能的认识，也为今后相关酶的改造和利用奠定了基础。

文章链接：https://doi.org/10.1002/anie.202200189